Effetto della quantità di carica sulle proprietà strutturali e sulla stabilità di quadrieliche di guanosine: analisi mediante diffrazione dei raggi X

Di Giacomo Caracciolo

Il lavoro descritto riguarda l’analisi delle proprietà di aggregazione sopramolecolare e lo studio del polimorfismo di sistemi liquido-cristallini liotropici formati da quadrieliche di guanosine. E’ noto che la guanosina ed alcuni suoi derivati danno luogo in acqua ad un peculiare fenomeno di autoassemblaggio che porta alla formazione di tetrameri stabili e, per impilamento dei tetrameri, alla costituzione di aggregati colonnari. I tetrameri di guanosine non sono impilati “in registro”, ma leggermente ruotati uno rispetto all’altro, in modo tale che le strutture a colonna che ne derivano risultano essere delle quadrieliche. E’stato dimostrato che in funzione della temperatura e della concentrazione di guanosina in acqua, le quadrieliche danno luogo ad un polimorfismo liquido-cristallino di tipo liotropico caratterizzato dall’esistenza di una mesofase esagonale (in cui gli aggregati colonnari sono paralleli e disposti in modo ordinato in un reticolo bidimensionale di tipo esagonale), o di una mesofase colesterica (in cui le colonne si allineano in piani ruotati l’uno rispetto all’ altro). Il comportamento polimorfico può essere messo in relazione con la distanza laterale tra le quadrieliche (distanza interassiale)che è ovviamente correlata alla concentrazione d’acqua del campione: all’aumentare dell’idratazione, aumenta la distanza laterale tra gli aggregati colonnari. Quando l’aumento della distanza riduce sufficientemente i vincoli di ingombro sterico, le quadrieliche sono libere di assumereconformazioni più disordinate, attraverso le quali vengono ridotte, per rotazione di una colonna rispetto ad un’altra, le interazioni intermolecolari repulsive, prevalentemente di tipo elettrostatico. Generalmente quindi le quadrieliche di guanosina formano strutture di tipo esagonale a bassa idratazione, mentre la transizione alla fase colesterica è determinata dall’aumento del contenuto d’acqua. Un altro aspetto da considerare è che la formazione delle quadrieliche mostra una forte dipendenza dalla presenza in soluzione di cationi alcalini, indicando una peculiare specificità ionica nella stabilizzazione dei tetrameri. Infatti, ogni catione tende ad occupare la cavità centrale dell’aggregato colonnare attraverso la coordinazione con gli otto atomi di ossigeno di due tetrameri successivi. I sistemi formati dalle quadrieliche di guanosine sono oggetto di un forte interesse biologico, dato che la formazione di tali strutture è stata messa in relazione con certe proprietà biofisiche della cromatina e dei telomeri, con il meccanismo d'azione di alcuni farmaci antitumorali, e addirittura con l'origine prebiotica della molecola di DNA. E quindi, allo scopo di ottenere informazioni ulteriori sulle proprietà strutturali, sull’autoassemblaggio, sulla stabilità e sulle interazioni tra gli aggregati colonnari, in questa tesi vengono analizzate le proprietà strutturali e le interazioni in quadrieliche modello.

• Lingua: Italiano
• Editore: Giacomo Caracciolo
• Data di uscita: 21 dic 2011
• ISBN: 9788863692693

Anteprima del libro

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1. Introduzione

1.1 Proprietà della guanosina

La guanina (2-amino-6-ossipurina), con la citosina, l'adenina, la timina e l'uracile è una della cinque basi azotate che costituiscono il DNA e l'RNA.

In forma libera o combinata, queste basi si trovano in quantità apprezzabile nella maggior parte delle cellule, in genere come prodotti di idrolisi enzimatica. Come tutte le basi, anche la guanina ha caratteristiche debolmente basiche, è relativamente insolubile in acqua ed ha un forte assorbimento nella zona dell' ultravioletto (da 250 a 280 nm). La guanina insieme alla adenina è una base purinica cioè una molecola aromatica piatta costituita da due anelli, mentre la citosina, la timina nel DNA e l'uracile nell' RNA, sono basi pirimidiniche cioè molecole aromatiche piatte a singolo anello. A costituire lo scheletro di DNA ed RNA, le basi azotate sono legate mediante un legame ß-N glicosidico ad uno zucchero pentoso chiamato riboso nell'RNA e deossiriboso (privo in posizione 2' del gruppo idrossile presente invece nel riboso) nel DNA (Fig. 1.1).

L'insieme della base purinica e dello zucchero a cinque atomi di carbonio è detto nucleoside e, nel caso in cui la base azotata sia la guanina, si parla di ribonucloside (guanosina) nell'RNA e di deossiribonucleoside (2'- deossiguanosina) nel DNA. In posizione 5' ogni nucleoside può essere legato mediante legame fosforico ad uno, due o tre gruppi fosfato prendendo così il nome di nucleotide mono-di e trifosfato rispettivamente.

Figura 1.1 Molecole di 2'- deossiguanosina 5' monofosfato (a sinistra) e guanosina 5'- monofosfato (a destra): le due molecole differiscono esclusivamente per la presenza del gruppo ossidrilico in posizione 2' dello zucchero.

Figura 1.2 Tetramero formato da quattro residui di guanosina legate fra loro mediante legami a ponte idrogeno di tipo Hoogsteen

Sia nel DNA che nell'RNA i nucleotidi trifosfato sono uniti da legami covalenti fosfodiesterici che congiungono il gruppo fosfato di un nucleotide a un gruppo ossidrilico dello zucchero del nucleotide adiacente.

Dei cinque nucleotidi purinici e pirimidinici presenti nel DNA e nell'RNA solo la guanosina 5'- monofosfato (GMP) e l'analogo deossiribonucleoside presentano la capacità, in acqua, di autoassociarsi in strutture stabili con la conseguente formazione di fibre e gels (Gellert et al., 1962; Saenger, 1984; Gushlbauer et al., 1974). Attraverso esperimenti di diffrazione dei raggi X è stato dimostrato che la componente comune di questi prodotti di autoaggregazione è un quartetto planare a forma di disco (complesso tetramerico) costituito da quattro residui guanilici (Fig. 1.2) legati fra loro mediante legami a ponte idrogeno di tipo Hoogsteen (Hoogsteen, 1959; Saenger, 1984). Strutture ordinate in fase isotropa e gels ordinati erano giàstati osservati in passato; molto recentemente è stato evidenziato anche unricco polimorfismo liotropico che include la formazione di fasi liquido-cristalline esagonali e colesteriche rispettivamente ad alta e bassa concentrazione (Mariani et al., 1989, 1993; Bonazzi et al., 1991; Amaral et al., 1992; Gottarelli & Spada, 1996, 1997). Anche queste strutture hanno come unità strutturale di base quartetti (tetrameri) planari a forma di disco legati tra loro da legami idrogeno secondo lo schema di Hoogsteen. I dischi hanno un diametro di circa 25 Å e, a causa delle loro proprietà anfifiliche, tendono ad impilarsi uno sull'altro ad una distanza di 3.4 Å (che è la stessa distanza tra le basi appaiate nel DNA), formando dei macro-aggregati cilindrici in cui gli zuccheri e i fosfati (la parte idrofilica) sporgono all'esterno (Fig. 1.3a). Attraverso esperimenti di diffrazione dei raggi X, microscopia ottica e dicroismo circolare è stata dimostrata la natura colonnare delle fasi liquido cristalline formate dalla guanosina e dai suoi derivati (Mariani et al., 1989; Spada et al., 1988; Bonazzi et al., 1991). E'importante osservare che in ciascuna colonna i tetrameri non sono impilati esattamente uno sull'altro, ma ciascuno è ruotato rispetto all'altro di circa 35-45° (Fig. 1.3b), formando una quadrielica destrorsa, molto simile alle quadrieliche di poli(G) (Arnott et al., 1974; Zimmermann et al., 1975).

Figura 1.3 Vista laterale (sinistra) e dall'alto (destra) dei tetrameri di guanosina. I dischi non sono impilati in registro ma sono ruotati l'uno rispetto all'altro in modo tale da formare una vera e propria quadrielica.

Un'ltra caratteristica molto importante delle strutture formate dalla a guanosina è che i tetrameri, e quindi le quadrieliche, sono stabilizzati da cationi monovalenti: in particolare, la risonanza magnetica nucleare ha fornito l'evidenza che i cationi sono parte integrale dell'associazione tetramerica della guanosina tendendo ad occupare la cavità centrale del tetramero (Fig. 1.4a). Tuttavia, la stabilizzazione è differente a seconda del tipo di catione legato (Fisk et al., 1978; Detellier & Lazlo, 1980; Bonazzi et al., 1991; Mariani et al., 1993; Gottarelli & Spada, 1989). Questo effetto è stato spiegato considerando che, per favorire l'aggregazione, le dimensioni del catione che si lega al tetramero devono essere tali da permettergli di occupare la cavità centrale.

Figura 1.4 Stabilizzazione dei tetrameri di guanosina determinata dalla presenza di cationi alcalini (NH4+) i quali possiedono dimensioni tali da poter occupare la cavità centrale del tetramero (a). I cationi sono condivisi da due tetrameri successivi mediante coordinazione da parte degli otto ossigeni chetonici delle guanosina (b).

Ciascun catione è coordinato da quattro ossigeni chetonici di ciascun tetramero, occupando la cavità centrale in modo tale da essere condiviso tra due tetrameri successivi (Fig. 1.4b). Per quanto riguarda la natura dei cationi è stato osservato che Na+, NH+4 e K+ (in particolare questi due ultimi) hanno