Che effetti ha la Cortical Spreading Depression sul genoma?: Studi degli effetti molecolari sulle DNA metiltrasferasi e sullo stato di metilazione del DNA in sistemi modello

Di Sara Rainone

Il fenomeno della Cortical Spreading Depression (CSD) ha un ruolo cruciale in molte malattie del sistema nervoso, quali: l’ischemia, l’emicrania e l’epilessia. La CSD è un’onda di depolarizzazione, che si propaga lentamente all’interno del cervello, caratterizzata da una depressione nell’attività bioelettrica neurale che permane per parecchi minuti dopo l’insulto sia esso chimico, fisico o biologico. Il lavoro qui presentato ha come scopo principale l’analisi delle possibili modifiche epigenetiche legate al fenomeno della CSD.

• Lingua: Italiano
• Editore: Sara Rainone
• Data di uscita: 2 apr 2020
• ISBN: 9788835803232

Anteprima del libro

GH.

INDICE

1. INTRODUZIONE pag.1

1.1. La metilazione istonica..................................................................................pag.1

1.2. La metilazione del DNA................................................................................pag.5

1.3. Cortical Spreading Depression ...................................................................pag.15

2. SCOPO DEL LAVORO.....................................................................................pag.23

3. MATERIALI E METODI.................................................................................. pag.26

3.1. Trattamento per la CSD................................................................................ pag.26

3.2. Estrazione e purificazione del DNA genomico....….....................................pag.26

3.3. Frammentazione del DNA genomico…………............................................pag.28

3.4. Immunoprecipitazione del DNA metilato (MeDIP)......................................pag.29 3.5. Lettura al nanodrop........................................................................................pag.31 3.6. Analisi mediante Real Time-PCR..................................................................pag.32

3.7. Estrazione di RNA totali dalla corteccia di ratto...........................................pag.37

3.8. Analisi degli RNA mediante elettroforesi denaturante..................................pag.38 3.9. Analisi per RT-PCR.......................................................................................pag.40

3.10. Elettroforesi su gel di agarosio in condizioni native...................................pag.43 3.11. Amplificazione mediante RealTime-PCR...................................................pag.44

Allestimento delle culture cellulari di neuroblastoma umano(SH-SY5Y)

RNA….........................................................................................................pag.47

Differenziamento in vitro di cellule di neuroblastoma(SH-SY5Y)

mediante utilizzo di acido retinoico............................................................pag.47

Estrazione di proteine da cellule SH-SY5Y trattate e non trattatecon

acido retinoico e quantificazione con metodo Biorad..................................pag.47

Analisi elettroforetica su gel di poliacrilammide in presenzadi

SDS (SDS-PAGE)........................................................................................pag.50

3.16. Analisi di Western blotting..........................................................................pag.52

3.17. Messa a punto del sistema modello per lo studio del Preconditioning........pag.56 3.18. Saggio MTT…………………………………………………………….…pag.58

4. RISULTATI pag.60

5. DISCUSSIONI FINALI…………………………………………...........................pag.92

6. BIBLIOGRAFIA……………………………………………………………...….pag.100

Introduzione

La metilazioneistonica

La regolazione dell’espressione genica è un processo molto complesso e finemente controllato da fattori multipli, tra i quali quelli epigenetici. I meccanismi di regolazione epigenetica comprendono soprattutto la metilazione del DNA e le modifiche istoniche post-traduzionali. Questa serie di elementi di regolazione concorre a determinare uno stato di impacchettamento della cromatina più o meno rilassato, che influenzerà la trascrizione di geni critici per un determinato processo biologico, come per esempio lo sviluppo o le neoplasie.

Gli istoni sono proteine che interagiscono, insieme a proteine non istoniche, con il DNA all’interno del nucleo di cellule eucariotiche e ne consentono la compattazione necessaria per la formazione della cromatina.

Gli istoni sono dotati di una carica netta positiva che ne facilita le interazioni aspecifiche con il DNA carico negativamente. In ogni istone si distinguono due regioni differenti, di cui una più conservata, definita dominio histone-fold maggiormente coinvolta nella strutturazione del nucleosoma e una coda N-terminale che fuoriesce dal nucleosoma, interessata da diverse modifiche come acetilazione, ubiquitinazione e metilazione a livello dei residui di lisina, fosforilazione su residui di treonina e serina, ADP-ribosilazione. Le modifiche istoniche hanno una grande importanza nel garantire la regolazione dell’espressione genica e presentano significati diversi non sempre del tutto univoci: se l’acetilazione istonica assume quasi sempre il significato di apertura cromatinica, la metilazione delle code N-terminali istoniche induce attivazione o silenziamento genico, a seconda dell’istone considerato e del numero di metili aggiunti in corrispondenza del sito modificato.

L’istone H3 può essere metilato sui residui di lisina 4, 9, 27, 36 e 79 mentre l’istone H4 sulla lisina 20. In generale, la monometilazione dell’istone H3 sulla lisina 9 è associata ad attivazione trascrizionale, mentre la di- e la tri- metilazione sono associate a repressione trascrizionale; al contrario mono- di- e tri- metilazione dell’istone H3 a livello della lisina 4 si ritrovano associate ad attivazione trascrizionale (Akbarian and Huang, 2009, Berger, 2007).

Alti livelli di metilazione dell’istone H3K4 sembrano essere associati con il sito di inizio della trascrizione (TSS) di geni attivamente trascritti. Oltre al TSS la metilazione dell’istone H3K4 sembra anche essere correlata alla presenza e attivazione di regioni enhancers (Buratowski and Kim, 2010, Pekowska et all, 2011). Al contrario, la metilazione in H3K9 è legata alla formazione di regioni eterocromatiche, principalmente mediata dall’interazione con la proteina HP1 (Riddle et al., 2012).

Negli ultimi anni è stato ipotizzato che sulle code istoniche vengano a crearsi dei pattern di modifiche in grado di generare un codice epigenetico, capace di influenzare diversi eventi nucleari quali, ad esempio, il processo di inattivazione del cromosoma X, la formazione dell’eterocromatina e gli eventi di divisione mitotica. Le modifiche covalenti su un amminoacido o le combinazioni di differenti modifiche su vari residui amminoacidici potrebbero agire andando a modificare direttamente la struttura cromatinica, o alternativamente, reclutare fattori proteici in grado di farlo.

Si parla, quindi, di cross-talk che letteralmente significa dialogo tra le parti. Secondo questa teoria, i singoli istoni, non solo sarebbero in grado di contribuire al codice epigenetico intracellulare, ma sarebbero capaci di indurre ulteriori modificazioni a livello di residui amminoacidici diversi sia sullo stesso istone che su istoni differenti.

Esempio di crosstalk tra modifiche istoniche all’interno dello stesso istone è dato dalla stimolazione dell’attività acetiltrasferasica di GCN5 sulla coda dell’istone H3 dopo fosforilazione della Serina in posizione 10; il crosstalk può anche riguardare istoni diversi: la monoubiquitinazione dell’istone H2B può portare alla trimetilazione della lisina 4 nella coda dell’istone H3, mediata dal complesso Set1/COMPASS, modifica che può essere bloccata dalla vicinanza dell’arginina metilata sullo stesso istone (Lee et al., 2010) ( Figura 1).

Inoltre, modifiche istoniche possono influenzare la metilazione del DNA, comportando attivazione o repressione trascrizionale.

Infatti, è stato sperimentalmente dimostrato che la metilazione del DNA mostra una correlazione inversa con la metilazione in H3K4 ed una correlazione positiva con la metilazione in H3K9, collegandosi a chiusura cromatinica (Okitsu et al., 2007).

Ulteriori evidenze