Caratterizzazione della struttura del genoma delle piante di interesse agro-industriale dell'area mediterranea: ruolo degli elementi trasponibili e del DNA ripetitivo nell'evoluzione dei genomi, nell'adattamento all'ambiente e nella creazione di nuovi fen

Di Loredana F. Ciarmiello

Le sequenze di DNA ripetitivo costituiscono una componente significativa di molti genomi eucariotici e l’isolamento e la caratterizzazione di tali sequenze porta ad una maggiore comprensione dell’organizzazione del genoma di interesse. Il lavoro svolto ha condotto all’isolamento e alla caratterizzazione molecolare di due nuove sequenze di DNA ripetitivo dal genoma di Citrus limon e di Poncirus trifoliata.
Queste sequenze sono state anche trovata in piante correlate al genere Citrus, quali il Pompelmo e l’Arancio, e in generi strettamente correlati al genere Citrus quali Fortunella margarita e Poncirus trifoliata.
Inoltre, poichè la comprensione dell’instabilità genetica delle piante appartenenti al genere Citrus e dell’evoluzione del loro genoma potrebbe essere migliorata se fosse chiarito il contributo degli elementi trasponibili, è stato effettuato lo studio degli elementi trasponibili Ty1-copia e Ty3-gypsy like ed in particolare è stata analizzata la presenza, l’eterogeneità e la loro distribuzione nel genoma di Citrus limon, Citrus sinensis, Fortunella margarita e Poncirus trifoliata.

• Lingua: Italiano
• Editore: Loredana F. Ciarmiello
• Data di uscita: 19 mar 2012
• ISBN: 9788863697094

Anteprima del libro

SECONDA UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI NAPOLI

DOTTORATO DI RICERCA

IN

RISORSE E AMBIENTE

XIX CICLO

Tesi di Dottorato

CARATTERIZZAZIONE DELLA STRUTTURA DEL GENOMA DELLE PIANTE DI INTERESSE AGRO-INDUSTRIALE DELL’AREA MEDITERRANEA: RUOLO DEGLI ELEMENTI TRASPONIBILI E DEL DNA RIPETITIVO NELL’EVOLUZIONE DEI GENOMI, NELL’ADATTAMENTO ALL’AMBIENTE E NELLA CREAZIONE DI NUOVI FENOTIPI DI RESISTENZA

Dott.ssa Loredana Filomena Ciarmiello

ANNO ACCADEMICO 2005/2006

Caratterizzazione della struttura del genoma delle piante di interesse agro-industriale dell'area mediterranea: ruolo degli elementi trasponibili e del DNA ripetitivo nell'evoluzione dei genomi, nell'adattamento all'ambiente e nella creazione di nuovi fenotipi di resistenza

Loredana Ciarmiello

Narcissus - Self Publishing made serious

Edizione digitale: marzo 2012

ISBN: 9788863697094

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Edizione digitale realizzata da Simplicissimus Book Farm srl

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INDICE

Sintesi

I Una nuova sequenza di DNA ripetitivo nel limone [Citrus limon (L.)Burm.] e in specie correlate

II Caratterizzazione di una nuova sequenza satellite in Poncirus trifoliata (Flying Dragon)

III Distribuzione molecolare dei retrotrasposoni gypsy e copia-like in Citrus ssp e Poncirus trifoliata

Introduzione

1.1 Studio e conservazione delle risorse biotiche dell’area mediterranea

1.2 Sequenze ripetute: satelliti, microsatelliti e trasposoni

1.2.1 Le sequenze satelliti nelle piante

1.3 L’evoluzione del DNA satellite

1.4 La funzione del DNA satellite

1.5 Il DNA satellite nelle piante appartenenti al genere Citrus

1.6 Gli elementi genici trasponibili:struttura e funzione

1.7 Gli elementi trasponibili nelle piante

1.8 Il silenzio genico degli elementi trasponibili nelle piante

Obiettivi della Ricerca

Materiali e Metodi

3.1 Strategia

3.2 Le piante

3.3 L’estrazione del DNA da tessuto vegetale

3.4 Polymerase chain reaction tecnique (PCR)

3.5 Caricamento su gel, elettroforesi ed eluizione dell’amplificato

3.6 Clonaggio dei frammenti eluiti

3.6.1 Preparazione del vettore e dell’inserto di DNA scelto per il clonaggio

3.6.2 Reazione di ligasi per l’ introduzione dell’inserto nel vettore scelto

3.6.3 Preparazione delle cellule competenti

3.6.4 Trasformazione

3.6.5 Selezione dei trasformati

3.6.6 Preparazione del DNA plasmidico mediante lisi alcalina

3.6.7 Trattamento col PEG

3.6.8 Analisi dei ricombinanti

3.7 Dot-blot

3.7.1 Ibridazione

3.7.2 Rivelazione immunologia

3.7.3 Stima del DNA satellite nel genoma in esame

3.8 Sequenziamento dei frammenti di DNA clonati e analisi delle sequenze

3.8.1 Marcatura dei prodotti PCR mediante fluorocromi e sequenziamento

3.8.2 Purificazione dei prodotti marcati

3.8.3 Sequenziamento automatizzato dye-terminator

3.8.4 Software per l’allineamento e l’analisi delle sequenze ottenute in banca dati

3.9 Bioinformatica

3.9.1 Neighbor-Joining

3.9.2 Costruzione di alberi filogenetici

3.10 Analisi dello stato di metilazione

3.10.1 Digestioni enzimatiche

3.10.2 Southern blotting

Risultati

4.1 Una nuova sequenza di DNA ripetitivo nel Limone [Citrus limon (L.) Burm.] e in specie correlate

4.2 Caratterizzazione di una nuova sequenza satellite in Poncirus trifoliata (Flying Dragon)

4.2.1 Rilevazione, clonaggio e Southern blot del DNA satellite

4.2.2 Analisi della sequenza di stDNA: variabilità intraspecifica

4.2.3 Conservazione della sequenza satellite PN400 nel genoma delle piante appartenenti al genere Citrus

4.2.4 Analisi di metilazione

4.3 Distribuzione molecolare dei retrotrasposoni gypsy e copia-like in Citrus ssp e Poncirus trifoliata

Discussione

5.1 Importanza dell’isolamento di una nuova sequenza di DNA ripetitivo nel Limone [Citrus limon (L.) Burm.] e in specie correlate

5.2 Importanza della caratterizzazione di una nuova sequenza satellite in Poncirus trifoliata (Flying Dragon)

5.3 Ruolo dei retrotrasposoni gypsy e copia-like in Citrus ssp e Poncirus trifoliata

Conclusioni

6.1 Isolamento e caratterizzazione di due nuove sequenze satellite in Citrus l. e P. trifoliata

6.2 Isolamento e caratterizzazione di retrotrasposoni Ty1-copia e Ty3-gypsy nel genoma di Citrus ssp e Poncirus trifoliata

6.3 Applicazioni biotecnologiche dei risultati ottenuti

Bibliografia

SINTESI

I   UNA NUOVA SEQUENZA DI DNA RIPETITIVO NEL LIMONE [CITRUS LIMON (L.) BURM.] E IN SPECIE CORRELATE

Le sequenze di DNA ripetitivo costituiscono una componente significativa di molti genomi eucariotici e l’isolamento e la caratterizzazione di tali sequenze porta ad una maggiore comprensione dell’organizzazione del genoma di interesse. Ad ogni modo il lavoro svolto nel primo anno di dottorato ha condotto all’isolamento e alla caratterizzazione molecolare di una nuova sequenza di DNA ripetitivo dal genoma di Citrus limon.

La digestione del DNA di C. limon con Mbo I produceva un frammento preponderante di circa 600 bp. Il Southern blotting relativo al frammento di DNA marcato ha evidenziato bande multimeriche del frammento di 600bp nel digesto Mbo I. Questo dato conferma che è stato isolato un nuovo satellite, chiamato stDNA C. limon 600 (CL600).

L’analisi di metilazione, condotta utilizzando la coppia di isoschizomeri Sau3AI-MboI, dimostra che la maggior parte dei residui di citosina nel sito GATC di questo elemento sono metilati in C. limon. Questa sequenza è stata anche trovata in piante correlate al genere Citrus, quali il Pompelmo e l’Arancio, e in generi strettamente correlati al genere Citrus quali Fortunella margarita e Poncirus trifoliata.

II   CARATTERIZZAZIONE DI UNA NUOVA SEQUENZA SATELLITE IN PONCIRUS TRIFOLIATA (FLYING DRAGON)

Le sequenze di DNA ripetitivo, come già detto in precedenza, costituiscono una componente significativa di molti genomi eucariotici e l’isolamento e la caratterizzazione di tali sequenze porta ad una maggiore comprensione dell’organizzazione del genoma di interesse. Ad ogni modo il lavoro svolto nel secondo anno di dottorato ha condotto all’isolamento e alla caratterizzazione molecolare di una nuova sequenza di DNA ripetitivo dal genoma di Poncirus trifoliata.

La digestione del DNA genomico di P. trifoliata con l’endonucleasi di restrizione AfaI produceva un frammento preponderante di circa 400 bp. L’analisi di Southern blotting condotta sul DNA genomico della specie oggetto studio digerito con lo stesso enzima di restrizione ha evidenziato bande multimeriche del frammento di 400bp. Questo dato conferma che è stato isolato un nuovo satellite, chiamato DNA 400 (PN400). La famiglia satellite isolata compone circa il 25% del genoma in esame e risulta essere presente ed allo stesso modo distribuita anche nel genoma di altre piante strettamente correlate al Poncirus, quali Limone, Arancio dolce e Kumquat.

L’analisi di metilazione condotta utilizzando la coppia di isoschizomeri MspI-HpaII dimostra che la maggior parte dei residui di citosina nel sito CCGG di questo elemento sono metilati in P. trifoliata.

III   DISTRIBUZIONE MOLECOLARE DEI RETROTRASPOSONI GYPSY E COPIA-LIKE IN CITRUS ssp E PONCIRUS TRIFOLIATA

La comprensione dell’instabilità genetica delle piante appartenenti al genere Citrus e dell’evoluzione del loro genoma potrebbe essere migliorata se fosse chiarito il contributo degli elementi trasponibili.

Gli elementi mobili di DNA costituiscono la maggior parte del genoma nucleare delle piante. Attraverso le attività che promuovono, quali trasposizione, inserzione, escissione e ricombinazione ectopica, gli elementi mobili possono provocare sia il riarrangiamento del genoma, che della struttura di singoli geni. Ad ogni modo il lavoro svolto durante il terzo anno di dottorato è stato teso allo studio degli elementi trasponibili Ty1-copia e Ty3-gypsy like ed in particolare è stata analizzata la presenza, l’eterogeneità e la loro distribuzione nel genoma di Citrus limon, Citrus sinensis, Fortunella margarita e Poncirus trifoliata. Per analizzare i retrotrasposoni appartenenti ai gruppi Ty1-copia e Ty3-gypsy like nelle suddette specie vegetali è stata utilizzata la reazione a catena della polimerasi (PCR).

Cloni contenenti regioni codificanti per la pol-poliproteina e per la trascrittasi inversa dei retroelementi Ty1-copia-like sono stati isolati da Citrus limon, Citrus sinensis e Fortunella margarita; inoltre, alcuni cloni contenenti regioni codificanti per la trascrittasi inversa degli elementi Ty3-gypsy-like sono stati isolati da Poncirus trifoliata.

L’analisi di sequenza dei cloni isolati mostra un elevato grado di omologia tra le trascrittasi inverse degli elementi Ty1-copia e Ty3-gypsy-like, inoltre un elevato grado di omologia è presente anche con retrotrasposoni di altre specie vegetali non strettamente correlate al genere Citrus. L’analisi di Southern blotting mostra che copie intersperse di questi retrotrasposoni si sono integrate