Clonaggio E Caratterizzazione Del Promotore Dell'Ubiquitin E3 Ligasi Itch

Di Marisa Di Santo

Le E3 ligasi sono delle proteine che giocano un ruolo fondamentale nella proliferazione delle cellule tumorali. Fanno parte di una via di degradazione ubiquitina –dipendenti e possono contribuire alla tumorigenesi attraverso un’inappropriata degradazione di oncogeni.
I dati ottenuti nei miei esperimenti indicano una forte interazione tra il promotore del gene Itch, che contiene elementi di regolazione che possono accendersi o spegnersi quando serve, e il fattore p63.
Questo fattore di trascrizione, insieme a p53, in condizioni normali è inattivo ma in caso di danno irreversibile al DNA è attivato e induce morte cellulare.
E’ stato, quindi, mimato in vitro quello che potrebbe succedere alle nostre cellule quando all’improvviso “impazziscono”.In particolare, gli esperimenti sono stati eseguiti utilizzando una linea tumorale umana di osteosarcoma, in cui l’espressione di Itch è inibita dopo il trattamento con chemioterapici. E’ stato dimostrato che quando Itch non è espressa, i livelli di p63 aumentano. Di conseguenza la cellula arresta il proprio ciclo di crescita e cerca di riparare il danno, se questo è abbastanza grave va incontro a morte per apoptosi.
Avere chiaro il circuito di regolazione tra Itch e p63 ci consentirebbe di disegnare alcune strategie per inibire l’espressione di Itch al fine di regolare la chemiosensibilità nelle cellule tumorali.
Come prospettive future, Itch potrebbe rivelarsi come un potenziale target farmacologico nella terapia del cancro.

• Lingua: Italiano
• Editore: Marisa Di Santo
• Data di uscita: 20 dic 2011
• ISBN: 9788863692709

Anteprima del libro

UNIVERSITA’ DEGLI STUDI DI ROMA

TOR VERGATA

FACOLTA’ DI SCIENZE MATEMATICHE FISICHE E NATURALI

CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN

BIOLOGIA ED EVOLUZIONE UMANA

TESI DI LAUREA

Clonaggio e caratterizzazione del promotore dell'ubiquitin E3 ligasi Itch

ANNO ACCADEMICO 2007/2008

Clonaggio e caratterizzazione del promotore dell'ubiquitin E3 ligasi Itch

Marisa Di Santo

Narcissus - Self Publishing made serious

Edizione digitale: dicembre 2011

ISBN: 9788863692709

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Edizione digitale realizzata da Simplicissimus Book Farm srl

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INDICE

SUMMARY

1. INTRODUZIONE

1.1 La famiglia di p53

1.1.1 Struttura e funzioni di p53

1.1.2 Altri membri della famiglia: p63 e p73

1.1.3 Analisi bioinformatica sui rapporti evolutivi dei membri della famiglia di p53

1.1.4 Differenze tra il DBD di p53 e il DBD di p63

1.2 Il processo di ubiquitinazione

1.2.1 La reazione di ubiquitinazione

1.2.2 Diversi tipi di E3 ligasi

1.2.3. La struttura di Itch/AIP4(E3 ubiquitin-protein ligase Itchy homolog)

1.2.4 Itch bersaglio delle caspasi

1.2.5 L’inibizione di Itch regola la chemiosensibilità in vitro

1.3 Circuiti regolatori nella famiglia di p53

1.3.1 Il circuito regolatorio p53/MDM2

1.3.2 Il circuito regolatorio di p73/ ITCH

1.3.3 Circuito regolatorio p63/ITCH?

1.4 Regolazione dell’espressione genica

2. SCOPO DEL LAVORO

3. MATERIALI E METODI

3.1 Clonaggio nel plasmide pGL3 Basic del promotore del gene ITCH

3.1.1 Reazione a catena della polimerasi dei frammenti del promotore di Itch da DNA genomico(PCR)

3.1.2 Digestione dei prodotti di PCR

3.1.3 Digestione del vettore pGL3 Basic con endonucleasi di restrizione

3.1.4 Reazione di ligazione tra il vettore pGL3Basic e i prodotti PCR

3.1.5 Preparazione di cellule competenti con Ca Cl2 e trasformazione

3.1.6 PCR su minicoltura dei cloni ricombinanti

3.1.7 Sequenziamento dei cloni positivi (metodo di Sanger)

3.1.8 Preparazione del DNA plasmidico (kit Invitrogen Purelink HiPure Plasmid Midi-Prep)

3.1.9 Preparazione di un clone pGL3Basic con un frammento di 700bp del promotore ITCH

3.1.10 Trasfezione transiente con Lipofectamine 2000 (Invitrogen)

3.1.11 Saggio delle proteine con il metodo colorimetrico di Bradford

3.1.12 Saggio di attività della luciferasi

3.2 Espressione delle proteine fuse a GST (Glutatione S-Transferase)

3.2.1 Purificazione delle proteine fuse a GST utilizzando la resina Glutatione-Sefarosio

3.3 Saggio EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assay)

3.3.1 Preparazione della sonda marcata con [α-³²P]-dCTP

3.3.2 Saggio di ritardo della mobilità elettroforetica

3.4 Elettroforesi su gel di poliacrilamide (PAA) in presenza di SDS (SDS-PAGE)

3.4.1 Western Blotting

3.5 Soluzioni e terreni di coltura

3.6 Ceppi batterici

3.7 Vettori plasmidici

3.8 Oligonucleotidi

3.9 Colture cellulari

4. RISULTATI

4.1 Identificazione e caratterizzazione del promotore della E3 ligasi Itch

4.1.1 Identificazione della sequenza del promotore mediante analisi bioinformatica

4.1.2 Preparazione di costrutti contenenti 3 frammenti di dimensione diversa della regione 5’ UTR

4.1.3 Saggio di attività dei 3 frammenti del promotore di Itch sul gene reporter della luciferasi

4.1.3.1 Caratterizzazione funzionale del promotore di Itch

4.1.4 Identificazione del promotore minimo di ITCH

4.1.5 Aumento dell’attività trascrizionale del promotore in presenza del fattore di trascrizione p63

4.1.6 Aumento dell’attività trascrizionale di ITCH in presenza di chemioterapici

4.2 Analisi dell’interazione tra p63 e il promotore di Itch

4.2.1 Caratterizzazione strutturale del promotore di Itch

4.2.2 Espressione in batteri del dominio ricombinante GST-DBD di p63

4.2.3 Purificazione del costrutto GST-DBD di p63 alla resina Glutatione-Sepharose 4B

4.2.4 Saggio di ritardo della mobilità elettroforetica (EMSA)

5. DISCUSSIONE

6. CONCLUSIONI

7. BIBLIOGRAFIA

SUMMARY

p53 is a transcriptional factor involved in apoptosis, senescence or cell cycle arrest in response to different stressors such as oncogenic stimuli, DNA damage, telomere erosion, hypoxia and lack of signals for cell survival.

The discovery of two additional members of the family of p53, p73 and p63 has greatly complicated the understanding of regulatory mechanisms of the p53 family. The basic structural features of p53 protein is shared by the other two members of the family.

Despite this similarity, the genes p63 and p73 are much more complex, they give rise to proteins that may functionally mimic but also antagonises the activity of p53. Differential promoters produce two major protein isoforms that either contain or lack the N-terminal transactivation domain (TAp63/p73 and ΔNp63/p73, respectively). The isoforms that retain the trans-activator sequences (TAp63/p73) may perform functions similar to those of p53 protein. The truncated isoforms ΔNp63/p73 may act as dominant negative about the function of p53. Deregulated dominant negative p63 and p73 isoforms play an oncogenic role in human cancer and contribute to chemoresistance. Therefore in tumours where p53 is mutated or absent (more than 50% of human cancers) control of the p63/p73 proteins levels may be of critical importance in regulating the sensitivity of the transformed cells to chemotherapeutic agents.

The members of the tumor suppressor p53 family are under tight regulation by distinct ubiquitin-protein isopeptide (E3) ligases.

For these reasons, the main intention of this project is to analyze the mechanisms that regulate p73/p63 in terms of DNA damage induced by genotoxic agents commonly used in chemotherapy, through the study of the ubiquitin E3 ligase Itch. Work in literature says that p73/p63 can be efficiently degraded by Itch. However, it was not clear whether Itch, similar to the E3-ligase of p53 MDM2 may be, in turn, a transcriptional target of p73/p63.

The aim of this work will be to characterize the promoter of Itch, by isolating it and by analyzing its shorter fragments in order to identify the minimal promoter region involved in the transcription.

Finally, it will be tested whether the minimal promoter region is directly bound by p63 transcription factor in the consensus sequences identified by the use of prediction programs by EMSA assay. Specific oligonucleotides probes corresponding to the ipotetical p63 binding sites of the Itch promoter will be incubated with the purified p63-DBD domain.

In this thesis we’ll show that p63 is a key player in the control of the E3 ligase Itch’s expression and provides a new mechanism that may play a relevant role in the cellular response to genotoxic stress.

The ability of Itch to control the steady state