Neutralizzazione delle tossine del veleno di Echis carinatus con molecole vegetali contenute nei semi di Mucuna pruriens: un approccio proteomico
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Anteprima del libro
Neutralizzazione delle tossine del veleno di Echis carinatus con molecole vegetali contenute nei semi di Mucuna pruriens - Alessio Cortelazzo
Neutralizzazione delle tossine del veleno di Echis carinatus con molecole vegetali contenute nei semi di Mucuna pruriens: un approccio proteomico
Alessio Cortellazzo
Neutralizzazione delle tossine del veleno di Echis carinatus con molecole vegetali contenute nei semi di Mucuna pruriens: un approccio proteomico
Alessio Cortellazzo
Narcissus - Self Publishing made serious
Edizione digitale: aprile 2012
ISBN: 9788863697834
Edizione digitale realizzata da Simplicissimus Book Farm srl
Premessa
Questa tesi rappresenta la continuazione di un lavoro svolto negli anni presso il Dipartimento di Medicina Interna, Scienze Endocrino-Metaboliche e Biochimica, nato anni fa da una collaborazione con il professore John Aguiyi, dell’Università di Jos (Nigeria). E’ importante evidenziare che questa ricerca è iniziata da alcune informazioni, fornite dalla medicina tradizionale nigeriana, inerenti ai semi di Mucuna pruriens che, una volta ingoiati, conferivano una sorta di protezione contro il morso dei serpenti. La cultura africana e la cultura anglosassone, seppur profondamente diverse, confrontandosi hanno dato vita ad una collaborazione che ancora oggi ha dato i suoi frutti, grazie anche all’uso di discipline biochimiche innovative come la Proteomica. I risultati, pubblicati su prestigiose riviste fra cui Proteomics, dimostrano che è importante mantenere vivi la curiosità per la ricerca, il coraggio di conoscere e di dedicarsi a nuovi argomenti.
ABBREVIAZIONI
INDICE
RIASSUNTO
INTRODUZIONE
Piante medicinali e medicina tradizionale
Mucuna pruriens (Mp)
La storia della Mp: dall’Asia all’Africa, fino all’America centrale
Composizione biochimica dei semi
Usi tradizionali dei semi di Mp
Profilo fitochimico di Mp
Fattori nutrizionali
Fattori antinutrizionali/antifisiologici nei semi di Mp
Proprietà medicinali della Mp - Antinutrienti nella salute
Proprietà anti-ossidante della Mp
Attività contro il veleno di serpente
Attività antimicrobica
Serpenti, veleni di serpente e avvelenamento
Composizione del veleno di serpente
Enzimi contenuti nel veleno di serpente attivi sull’emostasi
Veleno della vipera Echis carinatus (EV)
Proteasi presenti in EV
Effetti di EV sull’emostasi e sulla coagulazione
Il proteoma plasmatico umano: substrato modello per lo studio della proteolisi
SCOPO DELLA RICERCA
MATERIALI E METODI
Materiali
Metodi
Preparazione di MPE
Separazione di P e NP
Precipitazione delle proteine
Quantificazione delle proteine
Frazionamento proteico
Cromatografia per affinità con Concanavalina A
Cromatografia in tandem a scambio anionico-cationico
Gel filtrazione
Cromatografia a fase inversa
Estrazione della L-Dopa
TLC
Western blot
MALDI-TOF
Gas-cromatografia
Preparazione del veleno
Preparazione dei globuli rossi e test di emolisi diretto e indiretto
Saggi cromogenici
Zimogramma
SDS-PAGE
Preparazione del plasma e trattamento con EV
2-DE
Analisi statistica e delle immagini
Clotting Time Test
RISULTATI
A. Descrizione strutturale di MPE e relative purificazioni di P ed NP
Caratterizzazione di P
Purificazione di P
Caratterizzazione della frazione NP
B. Proteine di MPE PLA2-simili responsabili della protezione verso EV
Esperimento sulla cross
reattività
Identificazione della PLA2 tramite MALDI-TOF
Dosaggio dell’attività PLA2-simile di gpMuc
C. Attività di EV
Attività emolitica
Test di emolisi diretto
Test di emolisi indiretto e neutralizzazione con MPE
Attività proteolitica
Effetto sui substrati cromogenici, sulle caseine, sul fibrinogeno e protrombina
Effetto in vitro di EV sulle proteine plasmatiche: approccio proteomico
a. Plasma intero
b. Plasma depleto
D. Neutralizzazione con MPE dell’attività di EV
Proteomica in vivo con plasma di topo
Clotting Time Test
DISCUSSIONI
CONCLUSIONI
BIBLIOGRAFIA
RIASSUNTO
Mucuna pruriens (Mp) è una pianta medicinale frequentemente utilizzata dalla medicina tradizionale sulla quale sono stati effettuati svariati studi per un suo utilizzo a scopo alimentare, per la sua utilità nel trattamento del morbo di Parkinson e per la capacità dei suoi semi di neutralizzare gli effetti del veleno di Echis carinatus (EV). Proprio da quest’ultima proprietà dei semi di Mp abbiamo sviluppato le nostre ricerche approfondendo la conoscenza sulla composizione dei semi di questa pianta. Le componenti proteiche dei semi sono state studiate con l’analisi proteomica mentre le componenti non proteiche con l’uso di metodi estrattivi e saggi enzimatici. Caratterizzando le componenti dei semi abbiamo orientato le nostre ricerche verso l’identificazione del principio responsabile della protezione verso il morso dei serpenti. Con studi più approfonditi sulla componente proteica, abbiamo dimostrato che la protezione a lungo termine si basa sul meccanismo immunologico dovuto alla stretta somiglianza, strutturale e funzionale, fra una componente proteica (gpMuc) dell’estratto dei semi a la principale tossina (PLA2) contenuta in EV. Analisi approfondite sulle componenti dei semi hanno dimostrato che la neutralizzazione diretta delle tossine di EV può avvenire tramite molecole non proteiche, come L-Dopa, sulla PLA2 stessa o per mezzo di inibitori proteici contro le proteasi contenute in EV. Il veleno di questa vipera è una miscela complessa di tossine che contribuiscono alla sua letalità. Nel presente lavoro, l’attività proteolitica di EV è stata analizzata tramite saggi cromogenici, zimogrammi e SDS-PAGE. Per capire il meccanismo molecolare dell’avvelenamento, abbiamo studiato gli effetti, in vitro, di EV sulle proteine plasmatiche umane. Abbiamo individuato i substrati proteici delle proteasi di EV e i loro frammenti proteolitici. Abbiamo analizzato l’attività proteolitica di EV su proteine standard
come la protrombina e il fibrinogeno oltre che sul plasma. Per stabilire le condizioni di analisi ottimali tra EV e le proteine plasmatiche, il plasma è stato incubato con EV (plasma trattato), depleto dalle proteine più abbondanti e sottoposto ad SDS-PAGE. I campioni dal plasma controllo e trattato sono stati inoltre analizzati con 2-DE/MALDI-TOF MS che ci ha portato all’identificazione di quattro classi di proteine plasmatiche che vengono proteolizzate da EV: proteasi, inibitori delle proteasi, proteine di legame e trasportatori. Abbiamo constatato che EV proteolizza le proteine intere ma anche i frammenti fisiologici. Inoltre, attraverso ulteriori analisi proteomiche, abbiamo testato, in vivo, l’efficacia dell’estratto acquoso dei semi di Mucuna pruriens (MPE) contro EV. Abbiamo studiato i cambiamenti nel proteoma plasmatico dovuti al trattamento con MPE e identificato le proteine responsabili della sopravvivenza del gruppo dei topi (CHALLENGED) trattati con MPE ed EV. Abbiamo studiato sei diversi gruppi: tre gruppi controllo (un trattamento con soluzione salina, un trattamento breve con MPE e un trattamento lungo con MPE); un gruppo trattato solo con EV; due gruppi trattati (un trattamento